液中dna的保存影响也很大,高温、湿度和紫外线等环境因素会加速dna的降解,从而影响提取成功率。
好在这感染者的血液本就漆黑,干涸之后活性保留反而比人类的血液活性保留的时间更长。
钟教授将提取任务交给了其中一名研究员,研究员迅速的进行着准备工作。
准备工作如下:
1 第一次使用时,在buffer w2 ncentrate 和buffer w1b ncentrate 中按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇。
2 buffer w2(12x96 试剂盒)配制:在提供的500 l 空瓶中加入15 l 10xbuffer w2,135 l 去离子水和350 l 乙醇,可用100无水乙醇或95乙醇。
3 根据瓶上标签将蛋白酶k 溶解于buffer pk 中,请勿旋涡振荡。
4 准备70c温浴。
5 使用前检查buffer bl 是否有沉淀析出,若出现沉淀,请于70c温浴加热至沉淀完全溶解后再使用。
完成试剂准备工作之后,在钟教授的首肯之下,研究员开始进行dna的提取。
具体操作步骤如下:
1 向96 圆孔板的每孔中加入20 ul 蛋白酶k。
2 加200 ul 抗凝全血到96 圆孔板中。
~undefed 若全血样品体积少于200 ul,用pbs 补充到200 ul。
~undefed 若样品为鸟类血,样品用量须低于10 ul。
~undefed 若需得到rna-free 的基因组dna,在步骤3 加入buffer bl 前加入dnase-free 的rnase a(20 g\/ l) 。
3 加200 ul buffer bl ,注意不要打湿每孔的边缘,用96 圆孔硅胶片密封各孔。
4 用力混合30 s。
5 3000 rp 简短离心使96 圆孔硅胶片上的溶液到96圆孔板内。启动离心机,当速度达到3000rp后即停止。