经筵日讲官，并被推荐为南京礼部尚书。
进入隆庆二年（1568年），赵贞吉继续受到重视，不仅担任经筵直讲，还参与文武边臣的重要讨论，如关于是否在张家湾招募十万南兵的问题，他坚决反对，最终决策者采纳了他的意见。此外，他还负责会试总裁工作，教授吉士，代行祭祀孔子大典，并为未来的明神宗朱翊钧讲授经典，其在教育和文化领域的贡献进一步加深了他在朝中的影响力。
隆庆三年（1569年）八月，赵贞吉的仕途达到了新的高峰，被任命为礼部尚书兼文渊阁大学士，正式进入内阁参与国家最高决策，同时监管詹事府。次年，他又获得了太子太保、荣禄大夫的荣誉头衔，并被赐予蟒袍鸾带，彰显了皇帝对其的器重。在外交政策上，赵贞吉积极推动与蒙古俺答部落的和平谈判，显示了其在处理边疆问题上的智慧与魄力。
然而，赵贞吉的性格也为他带来了不少挑战。他虽才华横溢，却性格刚烈，易怒且直言不讳，经常直接称呼其他重臣的名字，这种行为在等级森严的官场中无疑树敌众多。尤其是与同僚高拱、张居正的竞争关系，更是体现了晚明政治中人才济济却矛盾重重的复杂局面。高拱与张居正虽然资历较浅，但凭借自身的政治手腕和策略，逐渐在权力斗争中占据上风。赵贞吉与他们的摩擦最终导致了他在隆庆四年（1570年）因考察科道官员一事与高拱发生 不 合 ，上疏请求归乡，并于同年十二月解除了都察院的职务。
五、归乡着书
隆庆五年（1571年），赵贞吉在经历了官场的风风雨雨后，终于得以致仕归家，享受家庭的宁静与学术的自由。明穆宗对赵贞吉的贡献给予了充分的认可，不仅荫封其子赵鼎柱为左府都事，而且在“隆庆和议”达成后，再次优待其子赵景柱，荫为中书舍人，这些都反映了皇帝对赵贞吉个人及其家族的尊重与感激。归乡后，赵贞吉并未完全脱离世事，应门人之邀在圣水寺设教，继续传播学问，培养后学。
然而，平静的日子并未持续太久，隆庆六年（1572年）五月，穆宗突然驾崩，赵贞吉闻讯后悲痛欲绝，哀悼之情至深，以至于饮食难以下咽，最终导致身体虚弱，患上了严重的咳嗽。这段时期，赵贞吉不仅承受着丧君之痛，还面临了弟弟赵蒙