林则徐遵旨宣布自十一月初一日（12月6日）停止与英国的贸易。同年十二月初一日（1840年1月5日），林则徐被正式任命为两广总督，邓廷桢则调任两江总督。
然而，英国政府决心发动侵华战争，以报复中国禁烟措施。林则徐从情报和翻译的西方报纸中了解到，英国正准备派遣舰队前往中国沿海滋扰。林则徐先后五次奏请朝廷加强防备，并通知沿海各地督抚做好防御准备。道光二十年（1840年）五月底，英军抵达广东海域，第一次鸦片战争正式爆发。英军封锁珠江口，并进攻广州。林则徐严密布防，使英军未能得逞。英军受阻后，转而北上，六月初攻占了浙江的定海。
七月，道光帝改变了对英态度，命直隶总督琦善接受英国公文，并与英军司令懿律谈判。道光帝希望通过惩治林则徐和邓廷桢，并赔偿烟价来换取英军撤退。不久，道光帝又多次指责林则徐处理不当。尽管处境不利，林则徐仍坚持抵抗，并在矾石洋击败了英军舰队。然而，林则徐的坚持并未改变道光帝的态度。八月，林则徐上疏自请治罪，并驳斥了战争因禁烟而起的说法，指出“夷性无厌，得一步又进一步”，若不加以制止，恐怕后患无穷。然而，道光帝对此斥为“无理，可恶”，并称其言论为“一片胡言”。
九月初三日（9月28日），道光帝决定将林则徐和邓廷桢交由刑部严加议处，并要求二人留粤备查。初八日（10月3日），林则徐和邓廷桢被革职。十一月，琦善抵达广东，废除战备，并与英军私下签订《穿鼻草约》。
道光二十一年（1841年）正月，林则徐反对琦善求和，并与邓廷桢一道奔走内河要隘，筹议战守。正月初十日（2月1日），义律宣布占领香港。林则徐说服怡良上奏揭露琦善的真相，导致琦善被革职并被押解进京。此时，英军已突破虎门防线，威胁广州。林则徐自筹经费，招募福建壮勇防守。三月，靖逆将军爱新觉罗·奕山到广东主持战事，但并未采纳林则徐的防御建议。
四月二十一日（6月10日），林则徐抵达浙江镇海军营。他提供炮书，协助镇海炮局研制新式火炮，并改造炮台和防御工事。五月初十日（6月28日），道光帝将广州战败责任归咎于林则徐，指责他在任时未积极筹划防务。随后，林则徐被